Congresos
ELECTROPORACIÓN DE CIGOTOS DE RATÓN CON EL SISTEMA CRISPR/CAS9 PARA LA GENERACIÓN DE RATONES MODIFICADOS GENÉTICAMENTE
José María Fernández Toro [1], María Clemente Maltes [1], Laura Cernadas González [1], Juan De Dios Hourcade Bueno [1]
- Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares, Unidad de Transgénesis, Madrid, España
XVII Congreso de la Sociedad para el estudio del animal de laboratorio (SECAL) Santiago de Compostela 2023
MICROINYECCIÓN DE LA PROTEÍNA CRE RECOMBINASA PARA EL TRAZADO DE LINAJES CELULARES DURANTE EL DESARROLLO EMBRIONARIO
Juan De Dios Hourcade Bueno [1], Miquel Sendra Ortola [2], Óscar H. Ocaña Terraza [2], Jorge Nicolás Domínguez Macías [3], Miguel Torres Sánchez [2]
- Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares, Unidad de Transgénesis, Madrid, España
- Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares, Laboratorio Control genético del Desarrollo de Órganos y Regeneración, Madrid, España
- Universidad de Jaén, Dpto Biología, Jaén, España
XVI Congreso de la Sociedad para el estudio del animal de laboratorio (SECAL) Lleida 2021
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La Unidad de Transgénesis del CNIC tiene por principal competencia el desarrollo y generación de modelos animales modificados genéticamente, fundamentalmente murinos.
El concepto transgénesis ha quedado desplazado por el de modificación genética, pues gracias al desarrollo de nuevas herramientas en biología molecular y de micromanipulación, el “modelado” del material genético in vivo ha supuesto una nueva meta a alcanzar. Pero comencemos por el principio...
¿Qué es transgénesis?
Originariamente transgénesis es el conjunto de procedimientos y técnicas que permiten insertar material genético exógeno en una célula. El fin de esta modificación es tratar de estudiar ese fragmento de ADN en el contexto general de un organismo.
Hoy, ya no sólo estudiamos como un fragmento de material genético se comporta; hemos ido mas allá gracias a las nuevas herramientas que se han desarrollado. Tenemos la capacidad de modificar directamente el material genético de un individuo, eliminando selectivamente secuencias (CrispR-Cas9) no solo en el espacio sino en el tiempo (inserciones LoxP mediante CrispR-Cas9).
¿Podemos tener lo que queramos?
La respuesta es, hacemos Ciencia, pero no magia. En la Unidad de Transgénesis llevamos a cabo muchas técnicas y contamos con buenos resultados, sin embargo, no siempre biológicamente se pueden conseguir buenos resultados.
Considerando que trabajamos con animales de experimentación, tenemos que cumplir con estrictos requisitos en bienestar animal como son la reducción, el reemplazamiento y el refinamiento de los procesos. De esta forma, nuestro objetivo será hacer lo más eficiente el proceso.
En nuestras manos, las diferentes técnicas que llevamos a cabo tienen unos resultados aceptables.
Fig. 1 Porcentaje de crías positivas del total nacido en microinyecciones sobre cigoto
Fig. 2 Porcentaje de crías positivas del total nacido en OMGs Blastocisto/E8C
Fig. 3 Comparación de eficiencias entre sistemas de microinyeccion en cigotos y OMGs Blastocisto/E8C
Y después… ¿que podemos hacer además de investigar con nuestro modelo?
En la Unidad de Transgénesis del CNIC disponemos de un amplio abanico de técnicas que nos permiten conservar los modelos generados con la seguridad de cualquier imprevisto o inconveniente.
Para ello contamos con las siguientes técnicas:
Criopreservación de germoplasma:
Definimos como germoplasma al conjunto de células germinales portadoras de la información genética y capaces de dar lugar a una nueva generación. Los gametos, masculinos y femeninos de cada especie, esto es, espermatozoides y ovocitos. La congelación de este tipo celular comporta un conjunto de precauciones debido a la fragilidad de estas células.
Dado el amplio catálogo de protocolos de los que disponemos para poder conservar nuestro germoplasma, en la UT nos hemos decantado por estos dos protocolos.
En el caso de congelación de espermatozoides, recurrimos al protocolo establecido por el European Mutant Mouse Archive (EMMA). De esta manera cualquier usuario podrá intercambiar con otros investigadores material congelado en el CNIC, ya que cuenta con unos estándares reconocidos.
En nuestro caso, tenemos conservadas en el CNIC 396 líneas mediante congelación de esperma de ratón. Nuestras tasas de recuperación mediante Fecundación In Vitro son aceptables:
Criopreservación de embriones:
Otra posibilidad es la congelación de embriones de ratón. La ventaja que presenta es la de disponer de un genoma completo y no hay pasos intermedios para la recuperación de la línea. Se puede mantener conservado el genoma en homocigosis si la línea y el usuario así lo requieren. Por el contrario, dependerá de las capacidades reproductivas de la línea en cuestión, el tiempo para conseguir un numero suficiente de embriones podría demorarse.
En el CNIC tenemos conservadas 18 líneas en forma de embriones congelados. Desde la UT queremos dar un impulso a este sistema para ello ya estamos abordando nuevas estrategias para su consecución, como rebajar costes y aumentar la eficiencia de la técnica.
Electroporación de cigotos de ratón:
Una alternativa para la generación de modelos de organismo modificados genéticamente es la electroporación de cigotos de ratón.
En ese sentido, durante el periodo 2021-2022, la unidad de transgénesis del CNIC ha puesto en marcha el protocolo de electroporación para conseguir animales modificados genéticamente por esta técnica.
La eficiencia de la técnica oscila entre el 30-50% de eficiencia para la generación de animales KOs.
